摘要：以黃黏土、藕塘泥、豆餅粉、大曲粉、鮮酒糟、黃漿水、酒尾、脫水活性窖泥功能菌等為原料，制備一種濃香型酒人工窖泥，通過窖泥宏基因組DNA提取，建立16SrDNA、18SrDNA文庫，

然后對該窖泥16SrDNA、18SrDNA文庫進行高通量測序，最后進行微生物多樣性分析。

關鍵詞：人工窖泥；制備；微生物；多樣性分析
 

中國白酒有上千年的釀造歷史，具有鮮明的地域特色，是世界六大蒸餾酒之一。

俗話說“千年窖池萬年糟”、“生香靠發酵，提香靠蒸餾”，作為中國大部分白酒發酵載體的窖池，在白酒生產過程中無疑起到舉足輕重的作用。酒醅在窖池中密封厭氧發酵，酒醅、少量遺留空氣、窖池共同參與了這一完整發酵過程，窖池的優劣，窖泥里含有的微生物種類及豐富程度直接影響著后期蒸餾白酒的質量，優質的窖泥對白酒生產至關重要。

1材料

1.1黃黏土5.03

要求：土質較純，含沙量低，粘度較大。

1.2藕塘泥5.03

要求：種植蓮藕5年以上，塘泥無污染，無異雜物，含沙量低。

1.3豆餅粉200kg

要求：粉碎成面。

1.4大曲粉500kg

要求：中溫曲，外觀、指標均符合標準要求，粉碎成面。

1.5鮮酒糟500kg

要求：當日或前一日蒸酒后丟糟。

1.6黃漿水500kg

1.7濃香酒尾700kg

要求：按30%vol標準折算。

1.8專用輔料70kg

1.9脫水活性窖泥功能菌180kg

2窖泥制備

2.1脫水活性窖泥功能菌活化液的制備

在陶壇中按l：6（40°C～45°C）的溫水比例，將功能菌加水活化，在28°C～35°C的條件下，保溫活化4小時，在活化過程中每小時至少應攪拌一次。

2.2專業輔料液（制備方法同2.1）

2.3將粘黃土、藕塘泥打散，除去雜物，然后按配方要求做好計量，放置在窖泥制備場所。

2.4將各種固體材料混合折成堆，并翻拌均勻，然后攤平厚約30～40公分的方（圓）堆。

2.5將酒尾、黃漿水混合液（用氨水或碳酸銨調整PH6.5～6.8）和功能菌活化液，專用輔料液噴灑在堆面上，邊灑邊拌合，直至合熟為止，然后經打泥機第一次打泥。

2.6將合熟的混合泥運至窖泥專用發酵池旁，再次經打泥機直接打入池中，入池溫度控制在30°C～35°C，PH6.5～7.0。池子裝泥量應低于池口沿20～30公分為宜。

2.7入完后將池口泥扒平，表面灑入含1.5%vol的酒液8～10公斤作為液封。上面蓋好塑料布，周邊用土壓實，進行厭氧發酵30～40天。

3微生物多樣性分析

3.1實驗目的

對窖泥樣本進行miseq文庫制備（基因組DNA抽提、PCR擴增，AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收，及FTC-3000TM real-time PCR儀）。而后進行illumina miseq 2x300 bp 高通量測序及生物信息學分析。

3.2原核微生物項目結果報告

3.2.1測序數據統計

3.2.2多樣性指數分析結果統計

3.2.3稀釋性曲線

3.2.4窖泥原核微生物分析

通過窖泥宏基因組DNA提取，并建立16SrDNA 文庫，然后對該窖泥16SrDNA 文庫進行高通量測序。測序有效序列條數為94017；獲得45480個Reads，分成729個OTU。通過聚類結果可以得到該窖泥種菌群分布如下：

優勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）占比98.29%，其次為放線菌和變形菌；97.65%均為梭菌綱梭菌目；繼續分類，總序列的94.49%為瘤胃菌科；但是具體到菌的種和屬，根據目前數據庫比較，90%以上為未分類的種和屬，及部分雖然能分類但屬于未培養細菌。所以該窖泥具有開發新菌種及新基因序列的潛力。

根據窖泥研究文獻瘤胃菌科細菌是產己酸的主要菌種，而正己酸和乙醇形成正己酸乙酯是濃香型白酒重要的香型物質；該己酸菌類未在數據庫中檢索到種和屬，說明此窖泥可能具有獨特的己酸菌菌種，可能產生自己獨特風味的濃香型白酒。

3.3 真核微生物項目結果報告

3.3.1測序數據統計

3.3.2多樣性指數分析結果統計

3.3.3稀釋性曲線

3.3.4窖泥真核微生物分析

通過窖泥宏基因組DNA提取，建立18SrDNA 文庫，然后對該窖泥18SrDNA 文庫進行高通量測序。測序有效序列條數為70436；獲得35282個Reads，分成883個OTU。通過聚類結果可以得到該窖泥種菌群分布如下：

真核生物比較豐富，主要集中在綠藻門37.10%、輪形動物門18.49%、鏈形植物門13.27%等。優勢物種為Prototheca zopfii（左氏原壁菌），根據文獻對窖泥的研究，該窖泥中所出現的優勢真核物種對白酒釀造過程的作用未見報道。

4結論

從微生物分析的最終結果看，此次制備的濃香窖泥中，其優勢菌群為厚壁菌門、梭菌綱梭菌目、瘤胃菌科，而瘤胃菌科細菌正是產己酸的主要菌種。在發酵過程中，對己酸乙酯的生成起到主要作用，而且己酸乙酯是濃香型白酒典型的香味物質。該次制備的窖泥性能的優劣，我們將在以后的生產實踐中做進一步的研究。

（注：文章中的分析數據均摘自華東理工大學魯華生物技術研究所出具的山東景陽岡酒廠有限公司窖泥微生物多樣性分析報告。）