摘　要：以優質五糧發酵池的窖泥為基材，對其進行熱選條件的優化，分離純化后得到的己酸菌制成己酸菌液。觀察其產氣能力、生長周期、活菌數量，用以得到最優化的熱處理條件。

實驗中五糧發酵池的窖泥菌液，在90℃恒溫處理5min，冷卻后接入己酸菌培養液中培養，得到的己酸菌更優質。

關鍵詞：窖泥，己酸菌，熱處理，分離純化

汪慧慧　杜祥寶　李慶騰　秦方園　李順濤　習小紅　高碩　孫小雨

(山東百脈泉酒業股份有限公司)

1 引言

在中國白酒中，濃香型白酒有舉足輕重的地位，其酒質和產量，又離不開生產中菌種質量及數量的多少。己酸菌是濃香型白酒釀造中產己酸乙酯主體香成分的功能菌。它屬于厭氧棱狀芽孢桿菌，其孢子具有耐熱性。近年來，百脈泉酒業技術中心將優質五糧老窖窖泥為基材，對窖泥進行熱處理條件的優化，以得到更加優良的己酸菌菌種。該菌種產氣旺盛、菌種健壯，廣泛應用于濃香型大曲酒的窖池保養、人工窖泥培養等。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

樣品：雙輪底發酵池的窖泥，五糧發酵池的窖泥，三糧發酵池的窖泥。

培養基：無水乙酸鈉5g/L(AR)，酵母膏5g/L(AR)，硫酸銨4g/L(AR)，磷酸氫二鉀0.2g/L(AR)，硫酸鎂0.2g/L(AR)，碳酸鈣5g/L(CP)，硫酸銅指示劑。

器材：立式壓力蒸汽滅菌鍋，生化培養箱，N-120(A)型生物顯微鏡，無菌操作臺，實驗室超純水器，抽氣針筒，移液管。

2.2實驗過程

1.用無菌水配置3000ml的己酸菌培養基，封口后，121℃滅菌30分鐘。同時滅菌待用的250ml三角瓶，移液管。待培養基降溫至32℃～34℃時，放入無菌操作臺或無菌接種室紫外線滅菌20分鐘，分裝至250ml三角瓶備用。

2.取自然發酵池的老窖泥10g，用無菌水定容至100ml，充分混勻。熱處理條件進行處理。

3.將熱處理后的窖泥加入250ml三角瓶中，接種量為10%，充分混勻。最后每瓶各加乙醇含量為2%～3%，封口后放置33℃的生化培養箱中培養觀察。

3結果與討論

3.1窖泥的選擇

取百脈泉酒業的雙輪底發酵池的窖泥，五糧發酵池的窖泥，三糧發酵池的窖泥各10g，加無菌水定容至100ml ，搖勻。取原菌液1ml，加9ml的無菌水混勻，依次稀釋，得稀釋度10-1、10-2、10-3、10-4。用血球計數板顯微鏡計數，計數時注意稀釋度是否合適，不能太濃或太稀，計數得每克窖泥所含的總菌數。

實驗測得1g雙輪底發酵池的窖泥總菌數為3.8×1010個，1g五糧發酵池的窖泥5.1×1010個，1g三糧發酵池的窖泥2.6×1010個，其中五糧發酵池的窖泥總菌數含量最高，基于窖泥中微生物的種類和數量均定著窖泥的質量，本實驗選取五糧發酵池的窖泥為基材，開展己酸菌的熱處理條件優化的研究。

3.2窖泥培養液的熱處理條件優化

3.2.1熱處理溫度的選擇

取五糧發酵池窖泥，制備菌液，經熱處理后接種到液體培養基中，放置33℃的生化培養箱中培養觀察。

由表1可以看出，當水浴時間均處理10分鐘時，由于不同己酸菌孢子及其他菌類的耐熱程度有一定的差異，隨著溫度的升高，總菌數呈現下降的趨勢，但隨著溫度的上升，生長周期延長，菌種被鈍化。

根據生物顯微鏡觀察，不難發現，隨著溫度的升高，雜菌數量減少，90℃處理培養后未見雜菌。如表1。

3.2.2熱處理時間的選擇

由于菌液經條件為90℃10min處理后活菌數雖然減少，但根據生物顯微鏡觀察無雜菌，處理后發酵最能達到分離純化的目的。即本公司選定90℃為熱處理溫度，水浴時間分別設置為3min，5min，7min，10min，經熱處理后接種到液體培養基中，放置33℃的生化培養箱中培養觀察。

實驗表明，當溫度為90℃時，隨著處理時間的延長，總菌數減少，且生長周期增長。熱處理5min與3min相比而言，總菌數量差別不大，但熱處理3min后的培養液，鏡檢觀察有少量雜菌，故本公司選定熱處理優化條件為90℃5min。如表2。

3.3己酸菌菌液的性能測試

3.3.1己酸菌產氣觀察

經熱處理后的培養液，生長周期為5天，實驗中的生長周期為液體培養基中見明顯氣泡產生。延長培養時間，以熱處理后的液體培養基為母液，接種到第三代時生長周期縮短為4d，產氣旺盛，說明熱處理使己酸菌純化，且因受到鍛煉而增強了活力。

3.3.2已酸菌鏡檢及產酸鑒定

延長發酵培養時間到13d，先把待測菌液稀釋到合適濃度，用生物顯微鏡觀察只見桿菌和芽孢未見其他雜菌且生長活躍，直接計數可達6.3億個/m l。

取待測菌液3ml放入比色管內，再加入2%硫酸銅溶液1ml最后加入乙醚2m l，蓋好搖勻，靜置3分鐘，管內分層，上層可見綠色且顏色較深，說明己酸菌生長良好且有己酸產生。

4結論

擴大培養時己酸菌菌種的選取至關重要，本公司對窖泥的熱處理優化條件進行了嚴格檢測，熱處理溫度、時間這兩個因素相互影響，在單因素試驗結果的基礎上，結合本公司對己酸菌培養基擴大培養的純度要求，優化熱處理條件后得到最佳熱處理條件為：90℃，5min。

制備的己酸菌菌液菌種健壯活躍、產氣旺盛，在擴大培養時要注意厭氧培養，無菌接種操作過程。

制備的培養液廣泛應用于濃香型白酒的灌窖、窖池保養以及人工窖泥的培養，以期改善和提高濃香型白酒的質量。